Se define técnica histológica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al microscopio.
El examen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa que la luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar, después de haber pasado por las distintas lentes del aparato, a impresionar a nuestro órgano visual. Por esa causa, debe ser reducido a láminas muy delgadas y transparentes, las cuales lograremos efectuando una serie de operaciones que serán descriptas más adelante.
OBTENCIÓN DE LA PIEZA
El material a utilizar puede ser extraído de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano. Entre los animales de observación se eligen aquellos que por su semejanza con el ser humano pueden sustituirlo sin grandes diferencias, y cuya obtención y crianza puede ser fácilmente efectuada en el laboratorio.
Fases en la obtención de material animal:
- Muerte del animal: podemos producirla valiéndonos de un traumatismo brusco, o por la intoxicación a causa de una dosis exagerada de narcótico.
- Extracción de los órganos: conociendo la anatomía del animal, debemos dirigirnos directamente a los órganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos sean varios, es conveniente extraer primero los que más fácilmente se descomponen, estos son el páncreas y la porción inferior del tubo digestivo.
- Reducción a piezas: teniendo en cuenta que para el tamaño de las piezas debemos considerar muy especialmente las cualidades del fijador a usar, hablaremos de este asunto cuando tratemos la fijación.
Reducción de la pieza
Obtención de material humano:
El hombre no es sujeto de experimentación, esta verdad indiscutible hace que sólo en casos excepcionales se pueda obtener material humano en condiciones de ser estudiado histológicamente. De tres fuentes puede provenir el material humano: las necropsias, las biopsias y las piezas operadas. De éstas, sólo la primera puede darnos material normal; las dos últimas proporcionarán tejidos patológicos.
- Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadáver. Para histología normal es necesario que se trate de un cadáver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesión, por lo menos el órgano que se quiere estudiar.
- Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico.
- Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos inflamados, también pueden darnos material de investigación pero, como en el caso anterior, sólo servirán para anatomía patológica.
FIJACIÓN
La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima.
Fijación de la muestra.
Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan para tal fin.
Cualidades que debe tener un fijador:
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.).
2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.).
5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.
6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.).
5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.
6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
Manera de actuar de los fijadores
Varía con la composición o naturaleza de los mismos: coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los tejidos (recuérdese que éstos, en su mayoría, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molécula de hidrógeno con su cromóforo).
Fijadores químicos
Son los más utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitución.
FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).
d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares.
e) Bicromato de potasio al 3-5%.
FIJADORES COMPUESTOS:
En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos.
a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico.
FIJADORES FÍSICOS:
1. Desecación.
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.
5. Congelación y desecación.
DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA
Deshidratación
Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente.
Se dispone una lámina en un cassette de deshidratación.
Deshidratación en alcoholes sucesivos.
Impregnación por un disolvente de la parafina (aclaración)
Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol (este último es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratación no ha sido bien lograda y debemos repetir el baño de alcohol absoluto cerciorándonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no debe enturbiarlo.
Penetración de la parafina
Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina.
Penetración de la parafina a 56-58ºC.
Inclusión definitiva o formación del bloque
En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera.
Barras de Leuckart
A los 15-30 minutos la parafina se habrá solidificado completamente, recortamos los bloques en forma de pirámide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito de madera mediante una espátula calentada con la llama de un mechero y ya podemos realizar los cortes con el micrótomo.
Factura del taco para cortar.
OBTENCIÓN DE CORTES
El objeto de la inclusión que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones.
Consideraremos cuatro tipos de micrótomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelación, y el crióstato o criótomo.
- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guías especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.
- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.
Corte en micrótomo tipo Minot.
- Tipo congelación: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelación colocado debajo de la platina que utiliza la expansión brusca del anhídrido carbónico contenido en un cilindro con el cual se comunica.
- Crióstato: consta de un micrótomo tipo Minot incluido en una cámara de congelación. El volante de inercia que controla la realización del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance están situados dentro de la cámara fría (normalmente a -20º C). Pese a la disposición horizontal de la cuchilla, la obtención de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos más modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, así como enfriar rápidamente la muestra a -60º C gracias a la existencia de una placa de congelación instantánea. Frente al micrótomo convencional de congelación, el crióstato posee la gran ventaja de permitir la obtención de cortes mucho más delgados (por lo general de 4 µm y, en manos experimentadas, hasta 2 µm).
Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrótomo, en agua tibia contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos, previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histológica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuación se lo levanta.
COLORACIÓN
Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloración.
Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos.
Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante.
Clasificación de los colorantes:
Según su origen se clasifican en:
COLORANTES NATURALES:
- Animales (carmín)
- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)
- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)
COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA):
- Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos.
- Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).
- Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).
Por otro lado, las coloraciones pueden ser:
- Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante empleada.
- Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado.
- Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado.
Métodos de coloración:
- Coloración directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.
- Coloración indirecta: requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que la coloración tenga lugar.
- Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo.
- Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciación.
- Coloración simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (núcleo, fibras elásticas, etc.).
- Coloración combinada: se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores básicos y ácidos que contrastan por sus colores.
- Coloración panóptica: es una coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa).
- Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros que se necesiten.
- Coloración indirecta: requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que la coloración tenga lugar.
- Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo.
- Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciación.
- Coloración simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (núcleo, fibras elásticas, etc.).
- Coloración combinada: se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores básicos y ácidos que contrastan por sus colores.
- Coloración panóptica: es una coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa).
- Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros que se necesiten.
Colorantes más utilizados en histología humana:
HEMATOXILINA:
- Es un colorante vegetal.
- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposición) u oxidantes artificiales (óxido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potásico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solución colorante), comportándose en este caso como un colorante indirecto.
- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposición) u oxidantes artificiales (óxido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potásico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solución colorante), comportándose en este caso como un colorante indirecto.
EOSINA:
- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos halogenados con tres grupos arilo).
- Presenta autofluorescencia espontánea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas.
- Presenta autofluorescencia espontánea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas.
Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración.
Batería de Coloración H&E.
MONTAJE
Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.
La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.
La aclaración se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere un índice de refracción semejante al del vidrio.
Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto.
Se deja secar unas horas antes de su observación al microscopio.
PROTOCOLO GENERAL
A continuación se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra cátedra para la técnica de Hematoxilina - Eosína para preparados de uso didáctico:
I. Fijación
En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs.
II. Corte
Se le da el tamaño deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'.
III. Deshidratación
1) Alcohol 70º, 1h30'.
2) Alcohol 96º, 1h30'.
3) Alcohol 100º (l), 1h30'.
4) Alcohol 100º (ll), 1h30'.
5) Toluol, entre 1h30' y 3hs.
2) Alcohol 96º, 1h30'.
3) Alcohol 100º (l), 1h30'.
4) Alcohol 100º (ll), 1h30'.
5) Toluol, entre 1h30' y 3hs.
IV. Inclusión
1) Secado de la muestra con gasa.
2) Parafina 56º (l), 1h30'.
3) Parafina 56º (ll), 1h30'.
4) Formación de la barra.
5) 30' de frezzer.
6) Fractura del taco
2) Parafina 56º (l), 1h30'.
3) Parafina 56º (ll), 1h30'.
4) Formación de la barra.
5) 30' de frezzer.
6) Fractura del taco
V. Corte
VI. Coloración
1) Secado de los cortes en estufa a 58ºC, 15'.
2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa.
3) Xilol o toluol (II), 2'.
4) Alcohol 100º, 30".
5) Alcohol 96º, 30".
6) Alcohol 70º, 30".
7) Alcohol 50º, 30".
8) Agua destilada, 30".
9) Hematoxilina, 1´30".
10) Agua corriente, 2´.
11) Alcohol 50º, 15".
12) Eosina, 30".
13) Alcohol 96º, 10".
14) Alcohol 100º, 10".
15) Xilol, 1´ por lo menos.
16) Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.
2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa.
3) Xilol o toluol (II), 2'.
4) Alcohol 100º, 30".
5) Alcohol 96º, 30".
6) Alcohol 70º, 30".
7) Alcohol 50º, 30".
8) Agua destilada, 30".
9) Hematoxilina, 1´30".
10) Agua corriente, 2´.
11) Alcohol 50º, 15".
12) Eosina, 30".
13) Alcohol 96º, 10".
14) Alcohol 100º, 10".
15) Xilol, 1´ por lo menos.
16) Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.
RECOMENDACIONES ÚTILES
- Las técnicas histológicas pertenecen al tipo denominado "técnicas contrarreloj". Si Ud. está apurado no las empiece, déjelas para cuando su trabajo le permita dedicarse solo a esa actividad.
- Mantenga su laboratorio en orden, con todos los elementos de vidrio que va a utilizar perfectamente limpios.
- Rotule todos los frascos inmediatamente luego de preparar cualquier solución.
- Guarde siempre las soluciones en frascos de color caramelo.
- Mantenga los recipientes que contienen xilol, toluol y alcohol 100º siempre tapados.
- Nunca coloque xilol o toluol en recipientes plásticos porque resultan atacados por estas sustancias.
- Si debe trabajar con ácidos hágalo bajo campana. Si se derraman o salpican la piel, lave inmediatamente con abundante agua con bicarbonato de sodio.
- Cuando coloree prepare primero todas las soluciones, solo después comience con los pasajes del material.
- Si debe realizar simultáneamente varios procesos de inclusión, confeccione planillas de tiempos para cada uno de los materiales. Esto evitará confusiones.
- Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada técnica. Es muy importante respetarlos para obtener resultados satisfactorios.
- Antes de iniciar cualquier técnica, primero léala atentamente. Prepare el material de vidrio necesario, reúna los reactivos y colorantes, haga las diluciones, determine los tiempos, y después comience el proceso.
- Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante las primeras experiencias sus resultados no son lo que Ud. esperaba, verifique cada paso y repita tantas veces como sea necesario.
- Mantenga su laboratorio en orden, con todos los elementos de vidrio que va a utilizar perfectamente limpios.
- Rotule todos los frascos inmediatamente luego de preparar cualquier solución.
- Guarde siempre las soluciones en frascos de color caramelo.
- Mantenga los recipientes que contienen xilol, toluol y alcohol 100º siempre tapados.
- Nunca coloque xilol o toluol en recipientes plásticos porque resultan atacados por estas sustancias.
- Si debe trabajar con ácidos hágalo bajo campana. Si se derraman o salpican la piel, lave inmediatamente con abundante agua con bicarbonato de sodio.
- Cuando coloree prepare primero todas las soluciones, solo después comience con los pasajes del material.
- Si debe realizar simultáneamente varios procesos de inclusión, confeccione planillas de tiempos para cada uno de los materiales. Esto evitará confusiones.
- Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada técnica. Es muy importante respetarlos para obtener resultados satisfactorios.
- Antes de iniciar cualquier técnica, primero léala atentamente. Prepare el material de vidrio necesario, reúna los reactivos y colorantes, haga las diluciones, determine los tiempos, y después comience el proceso.
- Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante las primeras experiencias sus resultados no son lo que Ud. esperaba, verifique cada paso y repita tantas veces como sea necesario.
Tomado de: http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/plantilla.asp?zona=modtecni
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